中國科學院昆明植物研究所
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科研進展

昆明植物所研究發現通過新穎結合模式靶向Cav3.2緩解疼痛的黃楊生物堿

文章來源:植物化學與西部植物資源持續利用國家重點實驗室  |  發布時間:2023-12-29  |  作者:年寅  |  瀏覽次數:  |  【打印】 【關閉

 

  T-型鈣通道(T-type Calcium Channels,TTCCs;Cav3.1-3.3)是一類具有特殊生理功能的電壓門控鈣通道,在疼痛、癲癇及震顫癥等藥物研發中是重要的靶點。MERK、Neurocrine Biosciences、Jazz Pharmaceuticals及Cavion等制藥公司均開展了TTCCs創新藥物研發,以Z944、ABT-639、Suvecaltamide、MK-8998、CX-8998和NBI-827104為代表的合成分子也陸續進入了臨床研究。然而,上述分子到目前為止無一獲批上市,TTCCs藥物研發面臨巨大挑戰。目前,TTCCs藥物研發的一個需要突破的重要方向是解碼新穎活性分子與TTCCs的相互作用模式,為亞型選擇性活性分子的設計與研發提供結構基礎(上述分子無亞型選擇性,甚至在任意兩個TTCCs通道中都沒有明顯的偏向性)。

  黃楊屬植物(Buxus spp),如黃楊(B. sinica)、小葉黃楊(B. microphylla)、雀舌黃楊(B. bodinieri)和錦熟黃楊(B. sempervirens)等是中國著名的觀賞植物,深受文人墨客喜愛, 被喻為“木中君子”。同時,它們也有重要的藥用價值。我國科學家成功將代表性黃楊三萜生物堿(BAs)環維黃楊星D(CVB-D)開發成了治療心血管疾病的天然藥物(商品名:黃楊寧)。前期,研究人員率先發現CVB-D通過抑制Cav3.2發揮廣譜的緩解疼痛作用(Front Pharmacol. 2022, 13: 1081697),這進一步的發現激發了研究人員系統研究BAs的興趣。 

  中國科學院昆明植物研究所膜蛋白(離子通道)天然藥物研究人才組聯合華中科技大學萬落生團隊對3種不同結構類型,共24個黃楊三萜生物堿展開了系統研究,發現9,19-cyclo-artane-類型分子2和3(包含CVB-D),以及9(10/19)abeo-artane-類型分子9和10均對Cav3.2有顯著的抑制作用。有趣的是,2、3和CVB-D不具有TTCCs亞型選擇性?;衔?和10在Cav3.2和Cav3.1中分別表現出了9倍和30倍的選擇性,遠遠超過現有的抑制劑。值得指出的是10號分子對Cav3.2的抑制作用與在臨床開展研究的陽性對照Z944相當。 

  為了探究這些分子與通道的結合模式,通過Cav3.1-Cav3.2嵌合體的構建及點突變實驗發現Cav3.2中Domain III的S6上serine-1543殘基是與化合物9和10相互作用的關鍵氨基酸。當把serine-1543突變成Cav3.1上對應的alanine時(Cav3.2S1543A),這兩個分子對突變通道的抑制作用均顯著降低,特別是10號分子對Cav3.2S1543A抑制作用的IC50值與Cav3.1相當。同樣的,當Cav3.1上的alanine突變成Cav3.2上對應的serine時(Cav3.1A1502S),化合物9和10的抑制作用顯著增強。結合分子對接和分子動力學等計算輔助的方法,研究人員以實驗數據為基礎模擬了活性分子與Cav3.1/ Cav3.2的相互作用模式。研究結果表明10號分子在Cav3.2中部的空腔中形成一個類似“人”字形結構,C-3端甲氨基可以與serine-1543形成氫鍵,使其A-C環可以通過疏水作用很好地結合在Cav3.2的Domain II和III的開窗(fenestration)中。同時,C-20端的苯甲?;梢匝由熘罝omain I和IV開窗入口處的疏水區域,形成穩定的疏水結合?;诖?,C-16位上的乙酰氧基正好向上堵住了Ca2+通過Cav3.2從膜外進入膜內的selectivity filter。Cav3.1中由于在Domain II和III開窗中與serine-1543對應的位置是一個alanine,無法與10號分子C-3端的甲氨基形成氫鍵,結合力相對較弱?;衔?和10主要的結構差異在于A和B環的二面角不同,基于此9中C-3端的甲氨基與serine-1543的距離長于10中相應的距離(5.14 埃 vs 2.88 埃),減弱相互作用力,使其對Cav3.2的抑制作用和選擇性都低于化合物10。值得指出的是化合物8對Cav3.2抑制作用較弱且無選擇性。其與9的結構差別主要在于C-3位的甲氨基變成了二甲氨基,因此無法與serine-1543形成氫鍵。相似的,化合物11-16同樣缺少能與serine-1543形成氫鍵的官能團,缺乏抑制作用和選擇性。上述研究表明9(10/19)abeo-artane-型分子的構效關系與計算結果十分吻合。此外,研究人員的研究還表明化合物2、3和CVB-D像瓶塞一樣地封住了通透離子的路徑,這種作用方式是它們不具備TTCCs亞型選擇性的主要原因(圖1)。 

 

1BAs91Cav3.2通道的抑制作用機制研究 

  在緩解疼痛作用機制研究中,發現化合物10通過直接作用于小鼠DRG神經元Cav3.2通道(不影響其表達)抑制后去極化 (ADPs)和神經元放電頻率以降低神經元收到傷害刺激的興奮性。此外,基于野生型和Cav3.2基因敲除型小鼠動物實驗表明10通過選擇性作用于Cav3.2顯著緩解醋酸誘發的內臟痛、L-半胱氨酸誘發的軀體痛及坐骨神經結扎誘發的神經痛,且其(5 mg/kg)作用與陽性對照Z944(10 mg/kg)和mibefradil(10 mg/kg)相當(圖2)。 

 

210緩解疼痛作用機制研究 

  綜上,通過對BAs的系統研究,研究人員發現了一種結構新穎且對Cav3.2的選擇性明顯高于Cav3.1的鎮痛化合物。闡明了這類分子與Cav3.2相互作用的結構基礎,從分子層面為基于結構創新藥物設計與研發夯實了基礎。 

  近日,該研究工作以Analgesic Buxus alkaloids with Enhanced Selectivity for the Low-Voltage-Gated Calcium Channel Cav3.2 over Cav3.1 through a New Binding Mode為題作為熱點論文(Hot Paper)發表在國際著名期刊《德國應用化學》(Angew. Chem. Int. Ed. https://doi.org/10.1002/anie.202313461)。中國科學院昆明植物研究所科研助理恭燁、已畢業碩士研究生劉瑞、華中科技大學碩士研究生查宏婧為該論文的共同第一作者。中國科學院昆明植物研究所年寅副研究員、華中科技大學萬落生副教授為共同通訊作者。中國科學院昆明植物研究所是本工作的第一完成單位。本研究工作得到了國家自然科學基金面上項目、第二次青藏高原綜合科學考察研究項目、云南省自然科學基金杰出青年專項、中國科學院“西部之光”青年學者項目等支持。 

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(責任編輯:李雪)

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